聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。
无菌水冲洗盖玻片（3次 ，每次5分钟）。
可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。
在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。
磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的冲洗。
第一步：细胞固定

用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 ℃)固定细胞片15分钟。
用预冷的PBS冲洗细胞片两次。透化：如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。注：丙酮固定标本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。Triton X - 100是目前最流行的通透剂，可提高抗体的渗透程度。但这不适合与膜相连抗原的使用，因为它会将膜破坏。
PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。
第二步：封闭和孵育

PBST孵育细胞（1 ％牛血清白蛋白），室温30分钟，以封闭抗体非特异性结合位点（封闭液也可以是1 ％明胶或10 ％的血清，此血清需来自二抗产生的物种体内） 。
加入一抗在湿盒内孵育细胞片（在使用含1% BSA PBST稀释抗体的），室温1小时或4 ℃过夜。
缓慢倒出溶液，PBS清洗细胞片的3次，每次5分钟。
加入含1 ％BSA的二抗稀释液，室温避光孵育1小时（避光）。
缓慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分钟（避光）。
第三步：复染

在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育细胞1分钟。
PBS清洗。
第四步：封片和观察

滴加一滴封片剂封片剂质，盖上盖玻片。
用指甲油密封盖玻片，以防止干燥和显微镜观察时移动。
观察后的细胞片可避光保存在-20或4°C。