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牛人实验经验,都是细节

时间:2012-07-04 04:35来源:生物吧 作者:管理员 点击:
变性条件SDS LB直接裂解: 用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB久煮某些性质会改变)的1*SDSLB(或者略高1.5*)直接加到细胞或者组织
变性条件——SDS LB直接裂解:


用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB久煮某些性质会改变)的1*SDSLB(或者略高1.5*)直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDSLB都是过量的(因此不一定要严格参考SDS LB稀释比);如果SDSLB不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现tip吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住tip。这时候常规做法有两种,1.再煮5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min;2.如果10min煮样后,仍然吸不起来,才适当增加SDSLB,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若过长,蛋白会凝固,此时以失去继续WB的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀和水分层)
此方法的缺点,SDS LB煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法,因此,这种制备方法制备的样品有使用局限。

非变性裂解法(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)
裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用。
俺前boss nature文章上的裂解液配方是:20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)(此裂解液可用于抽提核蛋白),其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,其实用0.5mMPMSF替代这三种就好了;如果还要做磷酸化蛋白,加1mM Na3VO4(现加现用),10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。
此方法的优点:NaCl浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见,诸如0.15M(生理盐浓度)、0.3M、0.6M(高盐系列,裂解细胞时染色体会析出,细胞碎片和沉淀非常粘稠)及0.8-1.2M;0.3M及以下适合IP试验,0.6M及以上适合纯化蛋白,尤其相互作用较强的复合体,要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。
用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40,用于破坏核膜结构;可用到1%,但此时染色体会析出,沉淀粘稠。

组织块裂解:
组织块较大用匀浆的方法最合适,现在有不少转头很小的匀浆器。
当组织超微量的时候,比如50mg新鲜癌组织,我采用的方法是
1. 低温(剪)搅碎,成肉糜状。
2. 锡箔纸包裹好,放入少量液氮,快速敲击(控制力量,尽量避免弄破锡箔纸),进一步破碎;反复多次。
3. 用上述细胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集:
    用无血清培养基培养细胞,收集上清液用于WB检测;如果含量过低,需要用TCA沉淀富集。
理论上,从普通培养基中收集分泌蛋白,此时对细胞生长条件的影响最小,是最佳的实验条件;但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA(牛血清白蛋白)之类的蛋白质,除非你进一步分离纯化,否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦,尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候;用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白,会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白(主要是BSA)浓度过于富集,会非特异性粘附“任意”抗体,从而最终被识别。同理,采用SDS LB裂解细胞制备样品前,通常要用PBS洗涤,其目的之一是去除培养基中的BSA。
采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外(可能激活未知信号途径,诸如AKT等),还会出现的问题是:
1. 即使采用了无血清收集上清,仍然有大量杂蛋白,但相对好很多。
2. 选用了上清,由于蛋白浓度太稀,通常要采用TCA沉淀富集,再重新溶解。
a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高,因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失,尤其在离心过程,离心管的摆放非常讲究,要180度翻转离心两次。
b。重新溶解时,由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解,你要摸索充分溶解的条件,相对麻烦。
实际上,如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能,一般不建议检测上清,尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈,我曾经参与的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白,但90%的数据是celllysis;偶尔用到上清,也只是作为富集纯化该蛋白的原料,为进一步分析做准备。

样品制备完,应立即低温保存(-20度短期(几天);-80度长期;例外,IP用样品应直接进行IP,避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用)。SDSLB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题,SDS沉淀;SDS 4度就会沉淀,何况-80度。上样前应加热充分溶解,否则从加样口向下拖带(SDSLB不够,样品未充分溶解也会出现类似拖尾;上样过大也会)。

在样品制备过程中,另一个需要注意的问题是,从样品制备的起始阶段就要注意定量问题;WB本身系统误差有20%,太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种,短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品,从肿瘤组织的大小(称重)开始,裂解液的体积都是精确定量的,操作过程也尽量避免蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量,我将下一节讨论蛋白定量的不科学性,以及裂解液成分对定量的干扰。

蛋白电泳:

电泳胶的制备、配方、缓冲液配方,请参考分子克隆。经验之谈,8%胶最底边约36KDa,10%最底边约25KDa,12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白,转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%,180KDa左右,转膜效率对WB结果的影响都问题不大(300KDa蛋白如何,没有尝试过)。
电泳一般采用恒流,45mA-55mA(应根据电泳仪器适当调整,要注意仪器最高限压;此条件适合gibco modelV16型,胶宽20cm)。采用恒流的优点,保证最快速度完成电泳(电压会逐渐增大),省时且减少扩散;但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶,所以你必须想办法散热。散热不好,条带出现波浪状。

注意事项:
1.聚丙烯酰胺的30%母液会降解,要4度避光保存。
2.APS会失效,10%APS一般保质期才一个月左右。-20度分装长期保存。
3.注意Tris buff的PH值,以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异,所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线(即便在分离胶中),如果溴酚蓝前有红色染料,那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部(溴酚蓝此时涌动极缓慢,位于胶中上部)
4.上下层式电泳装置若漏液,哪边漏液,电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液,则装置处于短路状态,液体会过热。SDS-PAGE胶可能局部自溶,条带扭曲、变形。
5.配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑,但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒(摸上去疙疙瘩瘩),其坏处是,在该部位极易导致不均匀的胶块,样品经过该处或电泳散热不好,条带变形。如果是RNA的超薄胶,胶板的颗粒会导致局部巨大气泡,非常难于清除;蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是,由中学物理知识可知,玻璃表面越光滑粘附越牢,未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力,拔梳子或边条时会产生微小的错动,胶体下部出现大量气泡(夹在玻板和胶之间,这个关系不大);严重的错动会使上样时,样品从胶和玻璃之间的间隙漏光,或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动,可在电泳缓冲液中拔梳子(比水更好,有SDS润滑)。
判断玻板是否洗干净,用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的;最好用洗洁精之类,洗衣粉、肥皂都不好用。
6.上样时,不要把tip深入胶孔过深(或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头),可能会错开胶和玻板,样品会泄露。
7.未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡,否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品(含5ul 4*SDS LB),可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理,点marker的lane也要加入同样体积的LB。LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异,在新旧LB靠近的地方,条带会拉宽或挤压变形。因此,同一块胶上,煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。
8.增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连,所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍,而WB灵敏度是以10的几次幂量级的,所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集(可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍,并去除其它杂蛋白干扰)。增加上样量的另一个坏处是,本来高表达的蛋白,诸如内参,在同样WB条件下,可能出现荧光灼烧式粹灭(一晃而灭)或者条带中空。
仍以6孔板80%以上汇合度为例,细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul(最少80ul,这样面积的培养板如果裂解液投入太少,回收时的损失就太大,上样就很难做到一致),而这种浓度条件下制备的样品,电泳时上样量要控制在5-6ul,最少2.5ul,最多10ul,10ul时内参基本已经开始粘连成一条线,带型出现波浪纹;当然并非不可以多上样,再多对WB结果影响不大(没有的仍然没有),且条带都很丑。
9.不同样品上样时,可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品,前者通常洗脱体积为15ul,刚好+5ul 4*SDSLB达到常规20ul上样体积;后者第8点提到只上5ul,同样+5ul SDS LB(比重同,不会互相挤压),最好补加10ulDDW使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品,中间最好用“空白”泳道隔开(空白仅指无蛋白,仍应加入8-8.5ul 4*SDSLB),这样才能确保每条带都很美观。
10. SDSPAGE胶配好暂时不用时,需用电泳缓冲液灌满空间(拔去梳子和底边边条后的间隙),用保鲜膜包裹防止液体蒸发,短期室温或稍长期4度保存。个人习惯为,灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层,保鲜膜包裹,次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较大,可以提前灌好SDS PAGE。

样品是否一定需要定量再上样?——不是的,这是浪费时间的一个操作。
我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。
蛋白定量首先需要一个参照系(标准蛋白),参照蛋白通常选择BSA,也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题,即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响;不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。因此你其实默认将所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠状态、光吸收情况下,然后做出的一个相对判断,这就存在一个“系统误差”——还不算上测量误差等等,就已经很不准确了。
其次,裂解组织或细胞的时候,那些裂解液中,某些溶剂本身会使CoomassieG250或者Bradford法(实际也是Coomassie染色)显色,尤其是去污剂之类;例如NP40,就会使Coomassie显蓝色,可以完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。因此,如果你的裂解液里面含有这类物质,所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加,根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律,自然定不准。【需要说明:我目前只知道NP40会这样,因为我们从来不去定量,没有做过更深入的研究。】
实际上保证你的内参一致,是从样品制备开始的,上节末尾有提到,不赘述。如果你从制备样品时就注意过定量问题,实际上通常内参差别不会太大。如果真的有差别,通常我们会先跑少量的样品,目的是让Actin或tubulin更清晰、不会粘连、不会过曝光。从而在第二轮跑正式结果前,根据第一轮的内参的荧光信号做微调,大致能做到相当;最多可能需要第三轮。以上的试验可以精确到0.1ul差异(我很多体外生化试验之前的调整酶量就是这样进行,此时根本不可能有足够的蛋白让你去定量)。当然凭曝光强弱调整上样量的前提是,你的WB技术很稳定,很可靠,这是需要相当多的经验积累,如果你一时掌握不了,可以让经验更丰富的师兄师姐或者导师帮忙。
    顺便提到,有人问过用Quantity One等定量软件对光密度定量后计算差别从而调整上样体积是否可以?——不可以。因为WB结果经过多重放大,精确计量只代表相对于对照组的相对比值,与实际比值还是有误差,所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。
如果非要做定量的话,要注意你的裂解液配方,把每种溶剂都先加入到显色液中尝试一下,避免那些本身会显色的物质出现在你的裂解液中;当然,某些物质的去除可能影响对组织蛋白的提取。所以这是一个两难的问题。

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大!

    首先必须澄清的是,很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分,实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高,真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱,以及如何正确使用抗体,这个问题下节讨论。
有一个简单的例证,Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时,通常转膜效果不理想(从预染的marker深浅可知),但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响(建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白)。没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题;尝试过浸泡(会泡烂的)、预电泳(会稍微好点)等等,效果均不理想。通常,最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分(要控制水流;水流太大,纸张会烂掉的),晾干再用;只要没冲烂可以一直反复使用。
其次,尽管转膜效率不起决定性作用,但由于WB的流程相对较长,所以每个步骤的叠加作用会被级数放大,因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好,因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。

针对提高转膜的效率,个人认为最先应该考虑到的是仪器的选用。
这里不是歧视“made inChina”,国内的厂家很少注重不断提高自己产品的品质,走低端策略,对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合;但说到转膜仪,能把一个简单的匀场电极做好的还真不多(就我道听途说的,国外厂家为了使电极之间场强更加均匀,那种大块金属板表面是镀过极薄的白金层);因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目前,个人使用过的国产电转槽(湿转)唯Tanon仿Biorad的还可以(算替它们免费打个广告吧,Tanon仿bioradmini3型电泳仪,在某些方面(主要是操作)上还优于Biorad原装;目前我认为“中国制造”的灵魂就是仿造并超越前者);半干转仪一律进口,用过Biorad、amersham和英国公司的scie-plas。
PS:批评一下Biorad。Biorad的半干转仪,其硬质塑料外壳会莫名其妙的碎裂(绝非摔裂、磕碰,因为底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍,基本不会移动;即便如此它自然就会碎裂),以致于其核心组件未坏的情况下,因外壳碎裂不得不报废该仪器(其外壳里包裹电源线,外壳碎裂,电源则无法接通,导致仪器报废——我们先后买过3台都是这样的毛病,其间间隔了3年,不能肯定近来Biorad有没有改进这个问题;如果没有,我想市场迟早会被其他公司所取代)
对这三款产品,Biorad的外壳有明显的质量缺陷,容易过早报废;amersham独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高,但蜂窝式使得与“三明治”的接触面减少,电转时散热不太好,做大蛋白(半干转仪也可以做大蛋白转膜,效率确实不如湿转,但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用)长时程(3hrs)转膜需要在4度冰柜或cold room进行;英国的产品,价格较高,公司不太出名国内不一定有代理,但质量和散热都非常好。
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