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流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群

时间:2016-08-17 10:39来源:生物吧 作者:管理员 点击:
早在1986年Mosmann等 [1] 依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-和TNF- 等细胞因子,介导与细胞毒和局部炎症有
早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子,介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答,参与细胞免疫及迟发型超敏反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子,其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体,与体液免疫相关。由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用,Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献,对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索,并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,用流式细胞仪很难检测出来,因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA (佛波酯)和离子霉素(Ionomycin)。 淋巴细胞在刺激物的作用下活化,分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素(Monensin)。Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要,我们主要围绕该问题进行探讨。
 
材料与方法
试剂
PMA(Sigma)
贮存液:PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃ 保存。
工作液:贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中,此时为1µg/ml。
Ionomycin(Sigma)
贮存液:Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃ 保存。
工作液:贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中,此时为50µg/ml。
GolgiStop(内含Monensin ,BD Pharmingen)
Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution,均购自BD Pharmingen。
抗体
细胞表面标记抗体:抗人CD3-APC,CD8-PercP,CD8-CYC,CD4-CYC。抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。
细胞内因子抗体:抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。以上抗体均购自BD Pharmingen。
 
实验方法
1 外周血单个核细胞的分离:取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后,轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后,轻轻吸取液相交界的单个核细胞,加入Hanks液3ml,混匀后,1500g离心5min。弃去上清,细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基(含10% 小牛血清,50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin)重悬,血细胞计数仪计数,调整细胞浓度。
2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中,每孔加入约5×105个细胞,加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA(10ng、20ng和50ng终浓度)和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞,同时加入0.7µl Golgistop,37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞,分为三部分,分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul,室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液(FACS Lysing Solution)1ml裂解残余红细胞,2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪(FACSCalibur,Becton Dickinson)检测细胞,Cellquest软件获取分析细胞,每个检测获取10000个细胞。采用前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中,每孔加入约5×105个细胞,加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml,同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞,加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后,收集细胞。将细胞分为两份,称为对照管和实验管,分别加入CD3-APC,CD8-PercP10µl,混匀,室温放置20min,加入红细胞裂解液1ml,混匀,室温放置10min,1000g离心5min,弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl,4℃放置20min, 使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml,1500g离心5min,弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul,对照管加入同型对照抗体,4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿,采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞(CD3+CD8-)。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞,加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后,收集细胞。将细胞分为两份,称为对照管和实验管,加入CD4-CYC 10µl,混匀,其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿,采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以CD4直方图设门区分Th细胞(CD4
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