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Western Blot实验成功必备利器---内参

时间:2016-06-23 22:19来源:生物吧 作者:管理员 点击:
什么是内参? 内参是一种特异识别高表达或普遍表达蛋白的抗体,在western blot中用于校正蛋白水平。 选择内参时需要考虑什么? 1. 检测大小:选择和目的蛋白大小相近的内参,但仍要能

· 什么是内参?



内参是一种特异识别高表达或普遍表达蛋白的抗体,在western blot中用于校正蛋白水平。
WB内参 (Western Blot Loading Controls


· 选择内参时需要考虑什么?



1. 检测大小:选择和目的蛋白大小相近的内参,但仍要能与目的蛋白区分开,足够大于或小于目的蛋白。若目的蛋白和内参的分子量大小相同,则不利于条带区分及数据解释。


2. 强表达:保证您选择的内参在样本中强表达。大多数通用内参是高表达的结构基因,旨在维持细胞基本生命活动(管家基因)。但一些稀有内参的表达并不是那么普遍。


3. 表达因素:所选内参的表达水平不受实验条件变化的影响(如,因GAPDH在糖酵解中的作用,所以研究新陈代谢过程时不建议作为内参)。最好的内参应识别在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白。

 

· 什么情况下需要用内参抗体?



1. 定量比较:对比不同点样孔间信号的时候,内参是必须的。只有各孔间内参的表达量相同,目标蛋白表达量的变化才是可信的。


2. 上样和转移确认:内参可以确认是否所有的样品都加入及各孔间的转移量是否相等。通过分析内参信号可以确定蛋白从胶转移到膜上是否均一。


3. 研究发表:大部分杂志要求做WB实验时提供内参数据,来确保实验样本中差异表达量是可信的。内参可以校正各孔间目的蛋白的表达量。

 

· 常见内参:





亚细胞定位 内参 MWkDa 注意事项
胞浆/全细胞 Alpha-tubulin 55 可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]Tubulin的表达受抗癌和抗真菌药物的影响。
Beta-actin 43 β-actin是染色质重塑复合体里面的组分,所以不适用于核提取物[1];可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]
GAPDH 37 因组织缺氧会上调GAPDH的表达,所以不适合做与氧有关的研究[3];可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]
Cyclophilin B 21  
线粒体 HSP60 60  
COX IV 17 很多蛋白质的分子量在15-17kDa之间,因此,如果目的蛋白大小和COX 4接近的话就有必要考虑用其他的内参抗体。
细胞核 Lamin B1 66 不适合于胚胎干细胞[4]
HDAC 60  
PCNA 29 不适合作为非增殖细胞的内参。
Histone H3 17 很多蛋白质的分子量在15-17kDa之间,因此,如果目的蛋白大小和Histone H3接近的话就有必要考虑用其他的内参抗体。
血清 Transferrin 77 Transferrin水平会受某些疾病状态和某些处理如视黄酸的影响。
 




PMID:



1. 12045110


2. 25429098


3. 10364451


4. 22116031
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