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流式细胞术实验中常见问题汇总和解决方法

时间:2015-07-08 10:50来源:未知 作者:大汉昆仑王 点击:
本文汇总了流式细胞术实验中常见问题 (无法标记、PE抗体检测不到但FITC可检测到、非特异性染色、荧光强度弱、散射光信号异常、结果与预期相反等) ,并给出了各种可能的原因以
本文汇总了流式细胞术实验中常见问题(无法标记、PE抗体检测不到但FITC可检测到、非特异性染色、荧光强度弱、散射光信号异常、结果与预期相反等),并给出了各种可能的原因以及对应的解决方法,已经十分全面,如果表格中的方法还是解决不了您的问题,欢迎到流式中文网(http://www.biobars.cn/club)发帖提问

问题 解决方法
无法标记
  • 确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。
  • 确保商品化抗体没有超过有效期。
  • 确保已正确加入足量的抗体。
  • 确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素,需加入连接有荧光素的二抗。
  • 确保二抗是好的,也就是说二抗曾经能与另外的一抗成功结合。
  • 确保使用了正确的二抗,就是说二抗能够识别你的一抗。
  • 如果使用的是PE或APC荧光素的抗体,确保该抗体未被冰冻过。
  • 你要检测的组织上是否表达该抗原?可查看相关文献了解该抗原的表达情况,或者同时做一个阳性对照。
  • 抗体是否能识别检测物种的抗原位点?可检查抗体的交叉反应列表(例如http://www.biolegend.com/cross_reactivity),看看抗体是否适用于你要检测的物种标本。不是所有的抗体都能够检测所有物种相应抗原。
  • 确保使用正确的激光来激发荧光素,并使用了正确的通道来检测该荧光。
PE抗体无法标记,而FITC抗体的结果却很好
  • PE荧光素可能冰冻过。如果冰冻过,建议另外买一管新的抗体。
  • 多聚甲醛(PFA)可能会导致此问题。PFA降解后可释放出甲醇,从而影响染色。所以切记PFA尽可能新鲜配制,或者细胞尽可能不要固定,染完色就立即检测。
非特异性染色
  • 非特异性染色可能是由于自发荧光。
    解决方法:用一管只加细胞不加抗体的空白管,查看细胞自发荧光水平。
  • 某些细胞可表达低亲和力的Fc受体CD16/CD32,这种受体可通过Fc片段结合大多数抗体。对于小鼠细胞,可使用SeroBlock FcR阻断该位点。
  • 非特异性染色也可能是由于二抗引起,建议选择一种只与一抗反应、却不会与检测组织发生交叉反应的二抗。
  • 确保洗涤充分。
  • 小心滴定抗体。降低抗体浓度可减少非特异性染色。
荧光强度弱
  • 荧光弱可能是由于抗体过度稀释。因此使用前通过正确滴定抗体,以确保抗体浓度适当。
  • 直标时,荧光弱也可能是由于前带现象引起(概念见表格后解释),因此,小心正确滴定抗体很有必要。
  • 荧光弱可能由于细胞数量过多。建议正确调整细胞密度,一般低于1×10E7/ml。
  • 荧光弱可能是由于抗原本身就表达低,可通过查阅文献,明确抗原表达水平。
  • 如果查阅到该抗原确实本身表达弱,那么建议选择更亮的荧光素(荧光素亮度排行见:)。
  • 在交叉反应明显的抗体中,其荧光强度弱于特异性高的单克隆抗体。
  • 一抗或二抗的孵育时间和温度均需优化。
散射光异常
  • 确保细胞是新鲜收集的,否则容易出现大量死细胞和碎片。
  • 对细胞进行刺激、活化时,可影响细胞散射光特性。
  • 如果要裂解红细胞,确保裂解液新鲜配制并且配制正确。
结果与预期的相反
  • 有些试剂可能会影响某些抗原检测,例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。
  • 裂解液也可以影响一些抗原检测,此时可采用PBMC提取法试试。
  • 有些抗原是表达在胞内的,故需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。
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