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免疫组化全攻略:新手与老手必读

时间:2014-08-07 12:50来源:生物吧 作者:管理员 点击:
在上世纪 30 年代,免疫组织化学( Immunohistochemistry ,简称 IHC )的原理就已经为人所知,但直到 1942 年,第一个 IHC 研究成果才正式发表。这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。哈佛大学

在上世纪30年代,免疫组织化学(Immunohistochemistry,简称IHC)的原理就已经为人所知,但直到1942年,第一个IHC研究成果才正式发表。这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。哈佛大学医学院的Albert Coons在《免疫学杂志》上发表文章,利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。自那以后,组织固定方法、检测标记和显微镜都在不断改进,让免疫组化成为诊断和研究中的一个必备工具。

在病理科,利用特异的肿瘤标志物,医生通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性,确定肿瘤的分期和分级,并确定细胞类型和转移的来源,以便找到原发肿瘤的位置。同样,IHC也能用于药物开发,通过检测疾病靶点的上调或下调来判断药物疗效。

免疫组化指的是根据抗体与抗原特异结合的原理来检测组织切片中的抗原(如蛋白)。immuno的词根来自操作中所使用的抗体,而histo意味着组织。另一种类似的技术是免疫细胞化学(Immunocytochemistry,简称ICC)。这两个词大家经常混着用,看着好像差不多,但实际上还是有点区别。这里顺便说说。

IHCvs. ICC

对于IHC,组织是来自患者或动物,经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片,封片后再处理。通过这种方法,研究人员可观察细胞组分的定位,同时维持周围组织的原先结构。

对于ICC,大部分细胞外基质及其他基质组分被去除,只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液,来自患者或动物(如血涂片、拭子等),或在实验室中进行的组织培养细胞系。

除了生物学来源,IHCICC在样品处理的程度上也有所不同。ICC需要透化,要么通过固定过程,要么是单独的透化步骤,这样抗体才能与细胞内的靶点相结合。而IHC可能不要单独的透化步骤,这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的IHC切片必须进一步处理,才能进行抗体染色。一旦处理好样品,IHCICC的染色操作就几乎没什么差异了。当然,就染色而言,根据所使用的抗体来优化还是少不了的。

设计一个成功的IHC/ICC实验

从技术上讲,IHC的原理很简单。首先固定样品,以保留细胞完整性,之后与封闭液共同孵育,避免抗体的非特异结合。随后将样品先后与一抗和二抗孵育,并通过显微镜分析观察信号。

然而,这并不意味着实验很好做。最大的挑战在于如何确定最佳的实验条件,让每个抗原都产生强烈而特异的信号。如果是个高丰度蛋白,那么挺好办,需要的固定时间短,封闭时间短,可以用荧光标记一抗直接检测。但如果要检测冰冻切片中的磷酸化蛋白呢?那可能需要抗原修复,外加放大检测。

IHC/ICC实验设计和优化的变量,如下表。

看完这些,是不是觉得有些头晕呢,这么多地方需要优化。其实也没那么恐怖,接下来会发布一些优化指南,包括如何制备样品,如何选择固定剂,如何优化抗体检测等,千万别错过。

如何制备样品

摘要:

  对于每一项IHC/ICC研究,组织和细胞样本的制备都不可掉以轻心。为了方便孵育,整个组织必须被切成超薄(5-10 μm)的切片,或切成小块用于整体免疫组化。对于ICC实验,在开始染色步骤之前,细胞必须附着在显微镜载玻片或盖玻片上。样本制备与固定方法密切相关,而固定方法又会受到检测技术(荧光 vs 显色)的影响。

对于每一项IHC/ICC研究,组织和细胞样本的制备都不可掉以轻心。为了方便孵育,整个组织必须被切成超薄(5-10μm)的切片,或切成小块用于整体免疫组化(wholemount IHC)。对于ICC实验,在开始染色步骤之前,细胞必须附着在显微镜载玻片或盖玻片上。样本制备也与固定方法密切相关,而固定方法又会受到检测技术(荧光 vs 显色)的影响。

在大部分情况下,某个实验变量将决定样本制备的最合适方法。例如,浸润固定在甲醛中的组织必须石蜡包埋,并利用切片机切片。或者,为了检测磷酸化依赖的表位,组织可能需要快速冷冻,因此在醇类固定之后就需要一个低温箱来进行样本切片。

石蜡包埋的组织

石蜡包埋为长期保存组织样本提供了最佳选择。组织在用石蜡包埋之前必须固定。固定可通过灌注或解剖后立即浸润来实现,一般需要4-24小时。不建议固定组织24小时以上,因为固定过度可能导致抗原的遮蔽。如有必要,组织在固定后可转移至酒精中,直至包埋过程。

因为石蜡与水是不混溶的,所以组织在加入熔化的固体石蜡前必须脱水。脱水是通过浸润在浓度递增的酒精中而实现的。这种方法逐步改变疏水性,让细胞伤害最小化。脱水之后,组织与二甲苯共同孵育,以去除任何残留的酒精。石蜡一般加热到60˚C进行包埋,随后过夜硬化。之后利用切片机用锋利的刀片将组织切成超薄的切片。切片在显微镜载玻片上干燥,并长时间室温储存。组织切片在开始IHC/ICC步骤之前必须再水化。石蜡是组织包埋的最便宜也是最常用的物质。不过,组织也可包埋在塑料中,凝固得更硬,并切成更薄的组织切片(1.5μmvs 5μm)。

冰冻组织

冰冻组织样本的好处之一是省去了石蜡包埋组织最初所需的固定步骤。在检测翻译后修饰如磷酸化时,快速冷冻特别有益。冰冻组织的制备可将组织浸润在液氮或异戊烷中,或埋在干冰里。对于冰冻组织,在冷冻和切片之后进行一个短时间的固定。冰冻组织切片最常用醇类固定,这避免了修复甲醛交联所遮蔽的表位的需要。冰冻组织在低温箱中切片,切片在-80˚C可储存多达1年。

冰冻组织切片的处理时间比石蜡包埋切片要短一些。不过,冷冻对于组织的长期保存是不够的,且细胞内冰晶的形成可能会负面影响亚细胞的细节。此外,冰冻切片通常比石蜡切片厚。这可能导致较低的显微镜分辨率以及差的组织形态学图像。因为冰冻切片通常保留酶的活性,所以封闭可能影响IHC检测的内源酶的活性也是特别重要的。


细胞样本

在开展ICC研究时,首先必须将细胞附着在固体支持物上,如显微镜载玻片或盖玻片。这对于贴壁细胞很简单,它们可直接放置在6孔或24孔板底部的高级无菌盖玻片上生长。将盖玻片预包被一层带电荷的聚合物(如多聚赖氨酸)和/或细胞外基质蛋白(如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白或胶原),可增强细胞附着。染色过程的所有步骤可在微孔板内的盖玻片上开展,向每个孔中加入适当的溶液并移走溶液。悬浮细胞可通过Cytospin®离心或与包被多聚赖氨酸的玻片孵育10分钟而附着在玻片上。

固定剂的选择

  理想的固定剂当然是:最好地保持细胞和组织的形态结构,并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而,迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固定。经同一固定液固定后,不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此,不同的抗原和样本必须反复试验,选择最佳的固定剂。

IHC/ICC实验中使用的所有样本必须经过固定,以维持组织形态,并保留目的分子的抗原性。固定改变了组织的化学组成,因此往往需要在维持组织结构和保留表位之间进行折衷。细胞或组织的不完全固定(固定不足)可能造成组织内目的蛋白的快速水解,并降低了特异的免疫反应性。然而,过度的固定(固定过度)可能导致表位的遮蔽或强的非特异背景染色,这可能会掩盖特异的标记。

理想的固定剂当然是:最好地保持细胞和组织的形态结构,并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而,迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固定。经同一固定液固定后,不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此,不同的抗原和样本必须反复试验,选择最佳的固定剂。

甲醛

甲醛是保留组织和细胞内蛋白靶点的最常用固定剂。甲醛介导的组织固定被认为依赖于蛋白-蛋白以及包含亚甲基桥(-CH2-)的蛋白-核酸交联的形成。甲醛能化学连接NH2(氨基)和CONH(肽段)基团,NH2NH,或NH2NH2基团。

甲醛是大多数IHC/ICC应用的良好选择,但并不是一种通用的固定剂。甲醛的固定过度会修饰氨基酸(属于表位中的一部分),并阻断抗体与之结合。然而,在大部分情况下,利用抗原修复技术可暴露表位,以还原抗体结合。研究还表明甲醛会诱导磷酸化依赖表位的细胞内转位,从细胞膜转移至细胞质。在这种情况下,冰预冷的无水甲醇或无水乙醇是适当的替代。

注意:甲醛溶液应当分装并冻存,或储存在4-8˚C不超过一个月。

醇类

最常用于细胞和组织固定的醇类是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构与水相似。因此,它们与水竞争蛋白氢键,取代组织中的水分子。这通过降低蛋白的介电常数,使蛋白在等电点沉淀,并由于构象的改变,阻断抗体-表位的结合。尽管醇类通过打断氢键而影响蛋白的三级结构,但它们似乎能稳定蛋白的二级结构。

不过,通常认为醇类不像甲醛固定剂那样保留组织形态。醇类不像甲醛那样渗透,主要用于固定冰冻组织切片和细胞。因此,醇类固定更适合膜表面抗原。在醇类固定之后不推荐进行抗原修复,因为它通常认为太过剧烈,有可能损害组织切片或细胞的完整性。

丙酮

丙酮是一种强的脱水剂,能引起组织蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷冻组织的切片。

组织的固定

在研究小动物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织时,整个动物的灌注固定是保留抗原的最佳方法。它包括用固定液来取代动物的全身血液。然而,整个动物的灌注还不足以固定目的组织。在这些情况下,解剖的组织可浸润在固定剂中。例如,4%甲醛是组织灌注和浸润固定的常用溶液。

为了在浸润固定过程中加强固定剂的渗透,建议组织厚度不超过10 mm。对于完整的固定,固定剂的体积应当是组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。由于固定不足或固定过度可能降低或破坏组织的免疫反应性,因此优化固定条件很重要。

培养细胞的固定

与组织样本不同,培养细胞的固定时间更短,且固定液的浓度更低。例如,用2%甲醛溶液在室温下固定20分钟,常常足以保留细胞形态和抗原性。

培养细胞的固定通常只是去除培养基,并加入固定液即可。不过,去除培养基后表面张力的变化可能损害某些细胞类型。如果是这种情况,固定剂可直接加入培养基中。例如,加入与培养基相同体积的4%甲醛,将得到2%甲醛溶液,它足以预固定细胞。在2分钟后,预固定培养基应当替换成新鲜量的2%固定剂。预固定步骤让细胞更加坚硬,这样它们就能够承受表面张力改变所引起的任何可能的有害影响。

一抗的选择与优化

摘要:

  在设计IHC/ICC实验时,一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化,以便观察到特异染色,并尽可能减少非特异的背景染色。然而,应该如何选择一抗呢?选择单克隆还是多克隆抗体?一抗孵育的条件该如何优化?请看本文。

在设计IHC/ICC实验时,一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化,以便观察到特异染色,并尽可能减少非特异的背景染色。这包括开展预实验,以确定每个一抗的适当孵育条件。抗原亲和纯化的多克隆抗体的稀释度通常低于单克隆抗体,但这些值必须根据经验确定。为了获得可靠特异的信号,应采用交叉反应性极少的高质量抗体。

一抗孵育的起始条件

选择一抗供应商

在搜索一抗时,产品很可能有几个不同的商业来源,而它们的抗体质量可能参差不齐。最初的选择也许决定了这是个成功的实验,抑或是个错失的机会。第一步是寻找独立验证。这包括在文献中检查抗体过去是否成功使用。许多供应商都可以为寻找这一信息的研究人员提供协助。另一个问题是询问抗体是否真的由供应商制造,还是它采购了之后转售?直接购买确保了商业来源对制造、质量控制流程、以及运输和储存条件的完全控制。此外,一旦抗体的使用出现问题,制造商会处于提供优质技术服务的最佳地位。

选择单克隆还是多克隆抗体

单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生,代表了同质群体,能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用,因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构想状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的,可识别多个表位,因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言,多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因,多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。

多克隆抗体的亲和纯化

多克隆抗血清是抗体混合物,它们由大量B细胞克隆产生。组成多克隆抗血清的抗体以不同的特异性和亲和力与目标表位结合,也与不相关的目标分子交叉反应(非特异相互作用)。为了富集与目的抗原特异性和亲和力最高的抗体,R&DSystems的多克隆抗体经过抗原亲和纯化。在此过程中,多克隆抗血清流过包含固定化抗原分子的亲和柱。特异抗体被固定化抗原保留,而非特异抗体流过柱子,被丢弃。随后从柱子上洗脱经抗原亲和纯化的抗体。抗原亲和纯化的抗体主要与目的抗原相互作用,降低了背景染色,与未纯化抗体相比产生了更一致的结果。

一抗孵育的优化

一抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响了染色质量。这些变量需要针对每个抗体和样品来优化,以便实现特异染色和低背景。优化通常是保持孵育时间和温度不变,而改变抗体浓度,以确定何时获得最佳信号和低背景噪音。例如,如果使用高亲和力的抗体,那么相对较高的浓度可能需要较短的孵育时间。相反,较低的抗体浓度可能需要较长的孵育时间。人们通常采用较长的孵育时间,以确保抗体完全渗透到体视学技术所用的组织切片。为了促进特异染色,较长时间的孵育通常在低温下开展(即°C vs 室温)。

组织切片染色方案的优化通常是从一抗在°C孵育过夜开始的。对于细胞染色,人们通常选择在室温下与一抗共同孵育1小时。抗原亲和纯化过的多克隆抗体的工作浓度(1.7-15µg/mL)通常比单克隆抗体(5-25µg/mL)要低。在比较不同浓度的相同抗体染色的样品时,在孵育步骤时必须使用一致的时间和浓度。当第一次使用新抗体时,建议开展预实验,检验各种抗体浓度。

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