一管法” HBV DNA 核酸提取与扩增实时荧光 PCR 定量检测方法的建立及应用

［摘要］目的 采用新研制的“微量核酸释放剂（Micro-Nucleic acid Releasing Reagent,MNRR；专利号：200310116699.9)”，建立“一步法”实时荧光定量PCR 扩增系统，并应用于临床检测。方法 对150 份HBsAg 阳性且HBV DNA 含量明确的乙肝患者血清标本和6份HBV DNA 含量为10³ 、10³ 、10⁶ 、10⁷ 和10⁸ copies/ml 的临床血清标本，进行实验内和实验间重复检测，同时采用国内批准上市的两家PCR 荧光诊断试剂（市售A 和市售B ）进行同步对照，采用HBV DNA 阴性的黄疽、溶血和脂血血清对己知HBV DNA 阳性标本进行10 倍稀释，取拉米夫定治疗前和治疗后1 小时的血清进行药物干扰因素实验。检测方法：将0.2ul的PCR 扩增管置入核酸提取仪的管架上，在管低加入3ul的MNRR 和3ul的待测血清，用带虑芯吸头的移液器轻轻吹打混匀，加30ul无菌石蜡油覆盖，置核酸提取仪99 ℃ 保温8 min 和10 ℃ 置1 min ，直接加入44ul的PCR 扩增液（蓝色），封盖后进入实时荧光定量PcR 扩增程序。荧光定量PCR 扩增系统采用TaqMan 探针和高度保守的正、反向引物等组成。结果 本文建立的“一步法”荧光定量PCR 系统快速简便，且具有良好的重复性、敏感性和稳定性。与市售试剂A 和市售试剂B 检测的相关性为0.984 ，与确认结果的相关性为0.993; 132份血清HBV DNA 含量大于10⁴copies/ml 的标本，本文方法检测结果全部吻合，吻合率达100% ，无一例假阳性，两家市售试剂均存在人为操作的假阳性（0.7%,6.0% ); 2 份HBV DNA 含量低于10⁴copies/ml的阳性标本，本文方法检测为阴性（1.3%) ，发生率低于市售试剂（2.0%和2.7% )；本文方法在两台仪器的检测的实验内和实验间CV 值在0.021-0.051 之间，明显低于市售A和B试剂的CV 值（0.053-0.126);48 份HBV DNA 标本单人处理和扩增时间为100分钟，是市售试剂检测时间的一半左右（150min~212min ）。并且本方法受黄疽、溶血及药物治疗等因素的影响较小。    结论 采用微量核酸释放剂建立的实时荧光定量PCR 方法，不需离心、振荡、开管和移液等操作，待测血清直接进入PCR 检测管中，首次将与标本同步进行核酸提取与扩增的血清标准质控品和进样指示技术引入系统，达到全程监控并大大降低操作误差，和传统方法比较具有变革性更新。

［主题词］微量核酸释放剂HBV DNA 荧光定量PCR

The development and application ofHBV DNA isolation and amplification in one tube in real-time PCR。

Abstract : objective To develop ONE tube method of real-time quantification PCR for HBVDNA which the serum can be directly added into PCR tubes using Micro-Nucleic acid Releasing Reagent ( MNRR ),and it's application in clinic , Methods 150 samples of hepatitis B positive sera ,conformed by two PCR reagents,and 6 shares of 3,6,7,8 Log copies/ml detected by replicate assay. TwoPCR reagents permitted by FDA controlled all data . To assess the effect of various known inhibitors,the licate sera samples containing 4 and 6 log₁₀ (copies/ml) of HBV DNA, diluted respectively by equivalence of HBV DNA negative serum containing bilirubin( 60mg/dl),hemoglobin ( haemolytic 20 per cent about),lamivudine and IFN( Theblood was taken within 1 to 2 hours after using ),were obtained. The assay as follow,4ul MNRR mixed with 4ul detection serum covered with 30ul mineral oil in amplification tubes ,and placed in nucleic acid releasing machine incubated at 99℃ for 8 min with the tube opening.44ulof blue Fluorescent-PCR reagents mixed in super clean bench was directly added to PCR amplification tube,and fol lowed real-time PCR procedure.Data acquisition and analysis are performed with ABI 5700 and Shanghai SLAN expressed as Ct

( Cycle threshold , CT ).Results Our ONE tube real-time PCR system can provide an accurate and highly sensitive rapid method to quantify Hepatitis B virus.The results ofthis study have a good correlation with the conformed results （r=0.993 ),andbetter with the results of commodity B reagent（r=0.984).95 shares of HBV DNA above 4.0 log copies/ml were allrepeated by our assay.There is no one artificial positive test , and there is only two shares of serum were detected as negative data whichconcentration were all lower 4.0 log copies/ml which need not report in diagnosis . The results from control reagent of commodity A and B all exit one to nine shares of artificial positive.The CV of our study in one test or other tests in one detector system or another detector system 15 limited 0.021 to 0.051 , but the CV of commodity A and B 15 zoosporeed of 0.053 to 0.126.The whole detecting ti me in 48 shares are completed within 100 min in our new method,and commodity A or B must be expend 150min to 212 min. In terference study showed that the inhibition was not detected with samples containing the three inhibitors in MNRRDNA isolation technique.Conclusion The real-time PCR with MNRR can provide an accurate,sensitive and good reproducibility rapid meth od of quantifying Hepatitis B virus.There is no artificial positive detection and lower negative artificial results without centrifugal,transferring,open and shut tubes and vortexing in the whole working procession.

Key words : Micro-Nucleic acid Releasing Reagent; HBV DNA; Fluorecent quantification PCR

本文采用新研制的“微量核酸释放剂（专利号：200310116699.9 )”，建立了“一步法”实时荧光PCR 定量检测HBV DNA 的方法。该技术将血清直接加入到PCR 扩增管，不需离心、振荡、无开管盖和移液等操作，采用标准血清质控品和标本同步进行处理和扩增，实现全程监控，反应液引入蓝色指示剂，在预变性时退色，具有无污染、操作简单、快速、准确等独特的优点。本文对150份乙肝患者的血清HBV DNA 进行定量检测，同时对病毒含量为3、6 、7 、8 数量级的患者血清进行5次重复性检测，检测结果的重复性明显优于传统的检测方法，同时不受黄疽、脂血、溶血及拉米夫定等药物治疗的影响，配备超净台可实现HBV DNA 荧光PCR 定量检测的“一室化”操作。现将具体情况报告如下：

材料与方法

检测标本及保存：选择2005年12月18日至2006在302医院住院和门诊就诊的150例乙肝患者的临床HBV DNA 定量检测血清。病毒含量大于10³copies/ml~l0⁴copies/ml的标本95份，介于10³copies/ml~l0⁴copies/ml的标本26份，阴性为29 份。选择血清HBV DNA定量copies 为3 、6 、7 、8 数量级的6份血清，分别进行等量分装于-70℃ 保存，使用时室温溶解并充分混匀、离心。对6份血清HBV DNA定量copies 为3 、6 、7 、8 数量级的血清分别进行4次重复性检测。对150 份临床血清标本采用国内市售的两家获SDA批准的HBV DNA检测试剂（简称市售A和市售B）对检测标本进行对照检测，并对可疑结果采用核酸浓缩方法进行最终复核确认。

干扰实验标本的选择：采用HBV DNA 阴性的黄疽、脂血及溶血血清对己知HBV DNA 阳性血清进行倍比稀释和使用拉米夫定治疗患者用药前和用药1 小时的血清分别进行干扰因素的检测。

血清标准品的制备：将NCCLs 确立的2.5x10⁸³copies/ml的阳性血清，用正常人血清进行10倍系列稀释，制备成10⁸、10⁷、10⁶ 、10⁵、10⁴、10³copies/ml的血清标准，使用0.2ml的无污染扩增管4ul管分装，于-80℃冻存，使用前室温溶解，与标本同步进行实时荧光PCR检测。

“一步法”实时荧光PCR检测：取0.2ml PCR扩增管放入AG96OO PCR扩增仪上，加4 川核酸释放剂，然后加入4ul的待测血清，用移液器轻轻吹打2-3 次，加30ul无菌石蜡油覆盖，在超净台中于70℃ 静置8min,10℃静置1min 。然后直接加入PCR扩增混合物，直接进入实时荧光PCR 扩增程序。PCR混合物包括正向引物（nt1743 to 1434 )5'-ACGTCCTTTGTT TACGTCGCGT-3'，反向引物（ntl743 to 1722 )5'-CCCAACTCCTCGCAGTCCTTAA-3',TaqMan 探针（nt 1680 to l704)5'- TGTCAACGACGGACCTTGAGGCATA -3'。PCR混合物包括10 X buffer,0.2nM 的4 X dNTP,3.5 mM 的MgC1₂ ,0.2uM正向和反向引物，0.3uM TaqMan探针，1.25^UTaq DNA,0.5^U UNG。扩增程序：50℃温育2min,( 94℃,2min-60℃,30s)x 1 ; ( 94℃，10s- 60℃ ，30s) x 39 ，在60℃检测荧光采用Ct 值和血清标准进行定量分析。

实时荧光PCR仪：ABI-5700 和SLAN Real-Time PCR

统计学处理：使用Excel计算机软件，所有数据用x士s 表示。采用平均值成对二样本分析t检验。

     结果

1.检测特异性：对150 份HBsAg阳性的乙肝患者血标本，同时与市售A和市售B试剂在同一检测条件下进行对照。结果表明，采用“核酸释放剂”检测的结果与实际符合结果的吻合率为98.7%，无一例假阳性,1份HBV DNA定量值低于1x10⁴cpies/m1的标本未检测到阳性（假阴性率为0.67%）。而市售A方法检测结果假阳性发生率为6.0%(9/150 )，假阴性为2.7%(4/150)；市售B假阳性率为0.7%(1／150)，假阴性率为2.0%(3/150)（表l ）。本文建立的方法与市售B试剂检测结果相关系数0.98（图l ) ，与最终结果的相关系数为0.99（图2 ）

2.灵敏性和线性：95份经NCCLs确认为HBV DNA 含量大于104copies/m1的血清标本，采用本文建立的“一步法”检测，结果全部吻合，二者的相关系数为0.99。采用酚一氯仿一异丙醇提取法重复确认为HBV DNA含量在10³copies/ml~10⁴copies/ml的26份血清标本，本文方法检测有25份阳性，1份假阴性。其中，市售A试剂6 份假阴性，市售B 试剂1份假阴性（表1）。采用正常人血清对NCCLs确立的HBV DNA含量为2.5 x 10⁸copies/m1的血清进行连续10倍稀释，理论浓度依次为2.5 x 10⁷copies/ml,2.5 x 10⁶copies/ml,2.5 x 10⁵copies/ml,2.5 x 10⁴copies/ml,2.5 x 10³copies/ml,2.5 x 10²copies/ml，然后采用本文方法进行检测。结果表明，该方法具有良好的灵敏性，在4ul时的血标本中可检测到25Ocopies/m1的HBV DNA。此10倍稀释的血清作为标准血清进行相关分析，实际结果与理论值的相关性达0.99 （图4，图5）。

3.重复性：对Log值为2,4,6,8的10倍稀释血清标本进行同批4复孔检测，结果表明，最大CV值为0.6%，明显优于文献报道［5］。对6份不同HBV DNA含量的血清标本进行连续4次检测，采用连续10倍稀释的已知血清作为血清病毒定量质控，按检测所得的HBV DNA含量（copies/ml）进行分析，显示其最大定量CV值为40.5%（表1 ，表2）。表明该方法具有良好的重复性，己超过FDA对HBV DNA定量结果CV%需控制在100%以内的质控标准。

5．与市售A和市售B试剂的结果对照：市售A检测结果为10³copies/ml~10⁴copies/ml,，而市售B结果为阴性的7份标本，本文方法检测结果5份为阴性，2份阳性，与最终检测结果完全一致；市售A检测结果为阴性，而市售B为10³copies/ml~10⁴copies/ml的6份标本，本文方法检测结果4份阳性和2份阴性，最终复核结果为 5份阳性和1份阴性（表 3 ）。

  目前国内外常用的核酸提取方法主要有：煮沸法、浓集法和Trizol裂解纯化法三种，QIAGENE提取试剂盒由于其价格昂贵而很少在国内用于临床检测。以上方法均需经2~ 5 次离心、3~7次的开盖洗涤等开放操作步骤，提取30个检测标本的核酸，大约需要1-3个小时，并且要求严格的实验条件和熟练的技术操作，不但费时费力，更重要的是容易导致操作过程中的污染和核酸丢失，致使检测结果重复性和稳定性较差，这是国家卫生部1998年在全国要求停止使用PCR技术进行临床检测的主要原因之一。在PCR的污染方面一直未能从根本上避免，从今年第一次全国临床实验室PCR时间质评统计报告可以看出，在HBV的检测出现较多的假阳性。据了解，大多参加质评的单位都经过2~3次的重复实验，或试剂公司从网匕核对后才将报告发出，在此情况下尚且出现如此多的假阳性，值得深入分析。我们认为PCR前处理存在过多的开盖、移管高温煮沸等烦杂步骤，是引起污染的重要技术原因之一，因此有必要研究更为简单的核酸提取方法。
   我们根据蛋白质和核酸独特的生化特点^[1-3]，成功研制出“微量核酸释放剂”并申报专利。该技术产品为蓝色液体，加入血清后迅速变为无色并将血清（血浆）中的胆红素、血红素和蛋白结合药物等物质凝结、退色，不但避免了蛋白对PCR扩增的影响，还解除了标本中黄疽和溶血等有色物质对荧光检测的影响，从而实现了检测血清可直接加入PCR扩增管进行实时荧光PCR检测，核酸释放只需在70℃保温8分钟，无需开关PCR管盖，直接将PCR反应液加入其内，实现了荧光定量PCR检测的“一步法”快速操作。本文利用该技术进行HBV DNA定量检测，并研制出与之相配套的荧光定量PCR诊断试剂进行临床研究。
   本文研究表明，采用该项技术方法对150份乙肝患者的血清进行对照和重复检测，结果表明，在大于10⁴copies/ml的临床报告标本，本文方法检测符合率为100%；一次实验的CV为0.021~0.034%，分次不同仪器检测的CV为0.038~ 0.051，明显优于目前市售产品，并且无一例假阳性，在26份低于10⁴copies/ml的阳性标本中，仅有2份检测为阴性，由于目前临床主要报告大于10⁴copies/ml的阳性标本，因此该方法的检测结果不影响临床报告。市售B采用浓缩的方法提取DNA ，其敏感性高于本法可以理解，但市售A和B试剂不但操作时间长，步骤繁琐，并且检测结果都存在不同程度的假阳性和假阴性，主要原因是操作过程中出现污染或核酸丢失所致^[4~7]。如上结果表明，表明“微量核酸释放剂”进行PCR检测，具有极好重复性和稳定性，尤其适合目前临床治疗的动态观察。
   基于该技术的PCR 操作不需离心、不需振荡、只需一个吸头，无开盖、移液等导致核酸丢失和污染等操作，无高温裂解引起的核酸环境污染之嫌，且操作简单、快速，对操作人员的技术要求较低，因此该项技术的应用使基层医疗单位能够开展结果准确的HBV DNA 定量检测成为现实。此为，本文方法解决了PCR 检测三室分割的要求，配备超净台，可实现PCR检测的“一室化”操作，对传统核酸检测的分区提出了挑战。并且该技术建立的方法可在国产的实时荧光PCR仪( SLAN ）上使用，其敏感性和重复性明显优于PE-5700仪器。

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