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灵敏度： 无论CT绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。
评价荧光PCR结果的标准
因素 建议 指标 效率 5个数量级梯度稀释 Slope～-3.3 R2>0.99 精密度 至少3个重复 标准差<0.25（0.5或者1个Ct之内） 灵敏度 增加低浓度样本的重复数 统计分析 除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照（如无模板对照，无 反转录酶对照等）以及模板质量。
3. Real-time qPCR定量方法
可以分绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-△△Ct。 3.1 绝对定量  3.2 2-△△Ct定量  3.3 其他定量方法  Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005  六、Real-Time qPCR常见问题分析 1.无Ct值出现  检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 2. Ct值出现过晚（Ct>38）  扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳  加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。 模板中存在抑制物，或模板浓度过高 4. 负对照有信号  引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。 5. 溶解曲线不止一个主峰  引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。 6. 扩增效率低  反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。 7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？   判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。 8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？  参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE) 模板的浓度太高或者降解 荧光染料的降解 |
