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Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手

时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧 作者:刘浩 点击:
由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的

由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测,很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。

本文就从real-time qPCR的发展史说起,包括real-time qPCR的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解real-time qPCR,彻底的从菜鸟到高手!
一、Real-time qPCR发展史
Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点,real-time qPCR由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年,美国PE公司(已经并入Invitrogen公司)成功研制了Taqman技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统,通过检测每个循环的荧光强度,通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列;Stratagene MxTM系列;Roche LightCycler@系列;Eppendorf Masercycler@;Corbett Rotor-GeneTM;Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展,科研水平不断提高,发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时,国内公司经过长期不懈的努力,也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述
1. Real-time qPCR原理
实时PCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。一般来讲,定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同,不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。

常用的荧光激发方式有两种:卤钨灯和LED;荧光检测元件常用两种方式:光电倍增管和冷光CCD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值。
2. Real-time qPCR的数学原理
首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值(Ct value),阈值(threshold),和基线(baseline)。一般来讲,第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢?我们来看PCR的扩增方程:

 


 

 

 

从线性方程上看,斜率(slope)为-1/lg(1+E),所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率(-3.3),就可以算出扩增效率(0.99)。一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR的种类
根据real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类:一类为探针类,包括TaqMan@探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;一类为非探针类,其中包括如SYBR@Green I或者特殊设计的引物(如LUX@Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。
3.1 Taqman@探针法
Taqman@探针是最早用于定量的方法。就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,也就是FRET反应;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。


3.2 分子信标法
分子信标:一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端,而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。与模板配对后,分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,它发出自身波长的光子。
 

3.3 SYBR@Green 法
SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR@Green 荧光染料,SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
 

3.4 LUX@Primers法
LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在有目标片断的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号。
 

4. Real-time qPCR和常规PCR的区别
 实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测
 敏感性高
 需要样品少
 特异性高
 精确定量
三、Real-time qPCR实验设计
实验设计其实比实验本身更重要!好的实验设计可以事半功倍,节省时间!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。对于一个real-time qPCR而言,首先就是实验材料的处理和准备;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%;进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。
1. 实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。现在新技术的发展,也有一些非液氮类的样品储存液 ,比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物设计
一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则:
 扩增产物长度在80-150bp。
 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
 产物不能形成二级结构。
 产物长度一般在15-30碱基之间。
 G+C含量在40%-60%之间。
 碱基要随机分布。
 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
 引物5’端可以修饰。
 引物3’端不可修饰。
 引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。遵循下面以下原则:
 尽量靠在上游引物;
 长度30-45bp,Tm比引物高至少5℃;
 5’端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量
四、Real-time qPCR操作过程
1. RNA提取和反转录
在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则:
1. 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然,这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头,新过滤的超纯水,进行RNA的提取。
2.Mix配制
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:
1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!
4. 所有成分加完后,离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(现在已经是ABI的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡,校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。我们以 ABI StepOne为例,详细看一下反应设置:
A. 首先是实验目的选择:定量还是其他。我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置:包括哪个是实验组,哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分钟)。循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置:
A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。
设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN!
五、Real-time qPCR数据分析
1. Real-time qPCR常见参数
 基线(baseline)
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
 阈值(threshold)
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
 Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
 Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。
2.影响Ct值的关键因素
 模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。
 反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
 PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCR扩增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来,反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3. 如何评估实时定量PCR反应的效果
 PCR扩增效率:

为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
 R2值:

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2,它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)来准确预测X值(量)。如果R2等于0,你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时,两个数值之间相关的可信度很好。
 精确度:

标准偏差(standard deviation,偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值,那么标准偏差就小;如果许多数据点都远离平均值,则标准偏差就大。实际上,足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明,独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%,那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度,标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大,分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释,标准偏差必须小于等于 0.250。

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